IPC分类号：
B29C64/118 | B33Y70/00
当前申请(专利权)人地址：
315211 浙江省宁波市江北区风华路818号 (浙江,宁波,江北区)
工商统一社会信用代码：
123300004195291066
摘要：
本发明公开了卡拉胶在生物3D打印中的应用，生物3D打印包括生物墨水和支撑浴，卡拉胶与GelMA溶液的组合在生物墨水中的应用，卡拉胶与磷酸盐缓冲液的组合在支撑浴中的应用。本发明采用上述成分的卡拉胶在生物3D打印中的应用，可有效操控无法挤出式打印的生物材料，如明胶衍生物GelMA的精准定位打印。
技术问题语段：
由于亚硫酸根固化GelMA的速度较慢，无法实现GelMA的快速原位交联封装，加上所使用支撑浴的自愈合速度有限，需要提高GelMA的浓度(＞10％w/v)来提高墨水粘度和原位交联封装速度，防止其扩散，但是高浓度的GelMA不利于包裹细胞的生长|目前能用于自由悬浮打印全粘度范围内GelMA的支撑浴还未见报道
技术功效语段：
[0015]因此，本发明采用上述成分的卡拉胶在生物3D打印中的应用，其有益效果为：1、κ-卡拉胶用于制备生物墨水时，不仅作为增稠剂来增强GelMA的打印性能，还增强了室温(25-28℃)下的可逆热敏交联稳定性，且不影响GelMA的生物相容性；
[0016]2、凝胶状的κ-卡拉胶/GelMA生物墨水可以在注射器中进行空间重组，并生物打印成具有自然过渡截面和梯度孔隙结构的复杂结构；
[0017]3、卡拉胶由于其独特的硫酸酯基团的存在，导致了其两步成胶的机制，低温下先通过无序的高分子链形成双螺旋结构，这些双螺旋在进一步地降温或者离子的作用下互相连接成网络，与ι型和λ型相比，作为支撑浴制备材料的κ类型具有成胶性强和典型的热敏性特征；
[0018]4、κ-卡拉胶支撑浴在较小的针头剪切和受力变形程度下就可以从具备弹性为主的固态性质转成具备粘性为主的液态性质，这利于墨水顺畅地嵌入沉积，针头离开打印区域后，流动的液态性质的κ-卡拉胶支撑浴快速地恢复到弹性为主的固体状态，该特性使得κ-卡拉胶支撑浴可以快速地包裹打印丝径并且通过高模量的支撑能力避免打印丝的坍塌变形；
[0019]5、κ-卡拉胶支撑浴极小的低屈服应力保证了在针头移开后，在周围静水压的作用下可以快速屈服并愈合，及时地填补被针头划开的空间，将针头移动时挤出的材料包埋，避免打印墨水上升；
[0020]6、打印过程和κ-卡拉胶支撑浴不会影响细胞活性，κ-卡拉胶支撑浴是生物相容的，低粘度GelMA生物墨水在κ-卡拉胶支撑浴中挤出打印的细胞培养载体在细胞培养和再生医学领域中具有应用前景。
权利要求：
1.卡拉胶在生物3D打印中的应用，生物3D打印包括生物墨水和支撑浴，其特征在于：卡拉胶与GelMA溶液的组合在生物墨水中的应用，卡拉胶与磷酸盐缓冲液的组合在支撑浴中的应用；
卡拉胶为κ-卡拉胶；
生物墨水的应用中卡拉胶的浓度为0.1％w/v、0.3％w/v中的一种；
使用生物墨水进行生物3D打印构建成骨细胞、人脐带静脉内皮细胞和小鼠骨髓间充质干细胞负载载体，进行体外培养。
2.根据权利要求1所述的卡拉胶在生物3D打印中的应用，其特征在于：支撑浴中应用中κ-卡拉胶的浓度为0.3％w/v、0.4％w/v和0.5％w/v中的一种。
技术领域：
[0001]本发明涉及生物3D打印技术领域，特别是涉及卡拉胶在生物3D打印中的应用。
背景技术：
[0002]常用于细胞3D培养的高活性生物材料，主要有胶原蛋白，纤维蛋白，脱细胞外基质(dECM)、明胶衍生物GelMA等。其中，甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)为烯烃双键改性的明胶，由甲基丙烯酸酐(MA)接枝取代明胶上的氨基获得，可光交联形成具有一定强度适于细胞生长与分化的三维结构，GelMA兼具天然和合成生物材料的特征，具备可逆的温敏交联特性和不可逆的光交联特性，由于其优异的生物活性和可调的理化性能，使得GelMA在组织工程等领域被广泛地使用，逐渐成为细胞3D培养的首选材料。
[0003]然而，GelMA的生物3D打印一直面临巨大的挑战。对于应用最广泛的挤出打印，由于GelMA粘度极低，类似于水，无法进行直接挤出打印，排除影响细胞相容性的混合打印，当前挤出打印GelMA的策略有、冷凝打印、原位光交联打印。由于原位交联程度难以控制，打印过程相对难以操控，目前的普及度较低，主要流行的还是通过冷凝增稠进行打印。
[0004]冷凝打印GelMA，主要是利用GelMA的冷凝特性预冷凝增稠进行打印，但由于明胶温敏性较窄，在室温24℃以上开始热溶，打印时需要控制GelMA预冷凝增稠程度，同时还需要控制打印时的环境温度，对温度控制的要求高且导致打印不稳定。此外GelMA冷凝形成的凝胶粘性较高，弹性较大，不利于顺畅挤出，综上，导致GelMA冷凝打印策略用户体验不好，有待进一步优化，提高其用户体验感和普适性。
[0005]生物功能化是后续各种组织工程与再生医学应用场景的保障，生物3D打印最终目标是构建功能化活性组织，相比于墨水的可打印性，墨水的生物活性是需要考虑的第一要素。然而，高活性生物材料配方墨水一般呈低粘度强度的理化属性，与可打印性的高粘度高强度要求背道而驰，无法直接挤出打印。致使墨水普适性高、应用最为广泛的挤出式生物3D打印长期处于平衡生物墨水活性和可打印性的矛盾性难题中。
[0006]随着生物3D打印发展，针对低粘度低强度墨水难以打印的难题，提出一种支撑浴介质中进行挤出式打印的技术，悬浮打印允许针头移动划开悬浮支撑液形成缝隙的同时沉积墨水到缝隙当中。悬浮支撑介质的存在使得打印丝避免了重力作用下的变形和坍塌。随后，关于各种材料制备支撑浴进行悬浮打印的研究陆续涌现，如卡波姆、琼脂糖、海藻酸盐、结冷胶、明胶等微胶体颗粒型支撑浴。
[0007]研究者们总结出，适于悬浮打印的支撑浴需具有宾汉流体特性，即当针状喷嘴在支撑浴里运动时，高剪切力使支撑浴呈流体特性，但在喷嘴移动的后方剪切力消失，支撑浴可快速自愈合并转换为刚性，可瞬间将挤出墨水包裹、固定在原位，从而实现层层沉积成形。
[0008]然而，目前为了防止墨水在支撑浴内扩散，多是针对墨水的交联机制，在支撑浴内构建墨水的实时交联环境，导致用于悬浮打印的墨水多是接触式交联机制的材料，如离子交联、酶交联、pH交联，对于非接触式交联的材料，如光交联，不太适用。同时，目前已知的支撑浴，自愈合速度有限，打印时，为了避免墨水被支撑浴挤压在喷头划过的裂缝中自由流动导致无法打印，要求墨水具有一定的初始粘度，以减缓其流动性。
[0009]而对于非粘性低粘度光交联GelMA的悬浮打印，有研究者利用亚硫酸根可实现GelMA交联的机制，开发出含有亚硫酸根的支撑浴用于悬浮打印GelMA。由于亚硫酸根固化GelMA的速度较慢，无法实现GelMA的快速原位交联封装，加上所使用支撑浴的自愈合速度有限，需要提高GelMA的浓度(＞10％w/v)来提高墨水粘度和原位交联封装速度，防止其扩散，但是高浓度的GelMA不利于包裹细胞的生长。目前能用于自由悬浮打印全粘度范围内GelMA的支撑浴还未见报道。
发明内容：
[0010]本发明的目的是提供卡拉胶在生物3D打印中的应用，可有效操控无法挤出式打印的生物材料，如明胶衍生物GelMA的精准定位打印。
[0011]为实现上述目的，本发明提供了卡拉胶在生物3D打印中的应用，生物3D打印包括生物墨水和支撑浴，卡拉胶与GelMA溶液的组合在生物墨水中的应用，卡拉胶与磷酸盐缓冲液的组合在支撑浴中的应用。
[0012]优选的，生物墨水的应用中卡拉胶的浓度为0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v中的一种。
[0013]优选的，支撑浴中应用中卡拉胶的浓度为0.3％w/v、0.4％w/v和0.5％w/v中的一种。
[0014]优选的，卡拉胶为κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶中的一种。
[0015]因此，本发明采用上述成分的卡拉胶在生物3D打印中的应用，其有益效果为：1、κ-卡拉胶用于制备生物墨水时，不仅作为增稠剂来增强GelMA的打印性能，还增强了室温(25-28℃)下的可逆热敏交联稳定性，且不影响GelMA的生物相容性；
[0016]2、凝胶状的κ-卡拉胶/GelMA生物墨水可以在注射器中进行空间重组，并生物打印成具有自然过渡截面和梯度孔隙结构的复杂结构；
[0017]3、卡拉胶由于其独特的硫酸酯基团的存在，导致了其两步成胶的机制，低温下先通过无序的高分子链形成双螺旋结构，这些双螺旋在进一步地降温或者离子的作用下互相连接成网络，与ι型和λ型相比，作为支撑浴制备材料的κ类型具有成胶性强和典型的热敏性特征；
[0018]4、κ-卡拉胶支撑浴在较小的针头剪切和受力变形程度下就可以从具备弹性为主的固态性质转成具备粘性为主的液态性质，这利于墨水顺畅地嵌入沉积，针头离开打印区域后，流动的液态性质的κ-卡拉胶支撑浴快速地恢复到弹性为主的固体状态，该特性使得κ-卡拉胶支撑浴可以快速地包裹打印丝径并且通过高模量的支撑能力避免打印丝的坍塌变形；
[0019]5、κ-卡拉胶支撑浴极小的低屈服应力保证了在针头移开后，在周围静水压的作用下可以快速屈服并愈合，及时地填补被针头划开的空间，将针头移动时挤出的材料包埋，避免打印墨水上升；
[0020]6、打印过程和κ-卡拉胶支撑浴不会影响细胞活性，κ-卡拉胶支撑浴是生物相容的，低粘度GelMA生物墨水在κ-卡拉胶支撑浴中挤出打印的细胞培养载体在细胞培养和再生医学领域中具有应用前景。
[0021]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式：
[0033]以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0034]通过下面的实施例可以更详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切变化和改进，本发明并不局限于下面的实施例。
[0035]实施例1
[0036]生物墨水的制备
[0037]S11、分别向浓度为0.1％w/v的κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶中加入5％的GelMA溶液(含0.25％ LAP)，37℃下搅拌至完全溶解，得到三种混合溶液。
[0038]S12、将S11中得到的三种混合溶液转移至不同的注射器中，4℃下冷却5min，得到不同类型的卡拉胶/GelMA生物墨水。
[0039]实施例2
[0040]S1、生物墨水的制备
[0041]S11、分别向浓度为0.1％w/v、0.3％w/v、0.5％w/v的κ-卡拉胶中加入5％的GelMA溶液(含0.25％ LAP)，37℃下搅拌至完全溶解，得到混合溶液。
[0042]S12、将S11中得到的混合溶液转移至注射器中，4℃下冷却5min，得到不同浓度的κ-卡拉胶/GelMA生物墨水。
[0043]S2、不同浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的理化性质
[0044]S21、测定流变行为：25℃下，在平行板之间加入新鲜κ-卡拉胶/GelMA生物墨水，间隙值为100μm，去除多余样品，测定得到κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的流变行为如图1所示。
[0045]S22、测定孔隙度：37℃下，将不同浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水和GelMA分别在磷酸盐缓冲液中浸泡2h，将浸泡前后的不同浓度κ-卡拉胶
[0046]/GelMA生物墨水在液氮中冷冻，冷冻干燥机干燥后使用扫描电镜扫描，得到的结果如图2所示。
[0047]S23、压缩试验：将不同浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的水凝胶样品置于流平板之间，以0.2mm/s的速率压缩至压缩比为50％，得到的结果如图3所示。
[0048]S24、测定杨氏模量：使用生物万能试验机测得结果如图1所示。
[0049]S3、对图1、图2和图3的分析
[0050]S31、由图1可知，图1是本发明不同κ-卡拉胶浓度的κ-卡拉胶/GelMA生物墨水力学性能图。
[0051]图1中的(A)为含有0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水的储存模量(G’)和损耗模量(G”)曲线。可知，在小于100％的应变下，含有0.1％w/v和0.3％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水发生了剪切诱导的凝胶-流体转变，而0.5％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水的剪切诱导率更高。
[0052]图1中的(B)为相同水凝胶的压应力-剪切速率曲线。
[0053]图1中的(C)为0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的粘度与剪切速率的关系。可知，当剪切速率增加到0.0001s-1左右时，0.1％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水粘度显著降低，表现为剪切变稀行为。相比之下，0.3％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水和0.5％w/vκ-卡拉胶GelMA生物墨水需要大于0.01s-1的剪切速率才能引起粘度变化。
[0054]图1中的(D)为0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的蠕变顺应性-时间和恢复顺应性-固化。可知，三组的蠕变恢复曲线形状不同，一旦施加恒定应力，含有0.3％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水就会出现瞬时变形。
[0055]图1中的(E)和图1中的(F)为0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的不同粘度-时间曲线。可知，经过两个循环后，三组生物墨水的模量与初始量相差不大，说明其在打印过程中保持稳定，且κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的恢复时间随卡拉胶的浓度增大而逐渐增加。
[0056]图1中的(H)为0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的不同粘度-温度曲线。可知，0.3％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水的热敏可逆交联温度范围为0-31.89℃，与0.5％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水的热敏可逆交联温度范围0-32.91℃相近，明显高于0.1％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水的热敏可逆交联温度范围0-27.15℃和纯GelMA的热敏可逆交联温度范围0-24.31℃。
[0057]S32、由图2可知，图2是本发明κ-卡拉胶/GelMA生物墨水中κ-卡拉胶溶解前后的结构形态、孔隙度和机械性能之间的关系图。
[0058]图2中的(A)为0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水，以及用上述生物墨水打印的支架在37℃磷酸盐缓冲液中浸泡前后的扫描电镜(SEM)图像。
[0059]图2中的(B)为37℃磷酸盐缓冲液浸泡前后同一κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的定量孔隙率。与图2中的(A)相比，溶解κ-卡拉胶的GelMA生物墨水支架孔隙率明显增强，且孔隙率随κ-卡拉胶浓度的增加略有增加。
[0060]图2中的(C)为含0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水在37℃磷酸盐缓冲液中浸泡前的压应力-应变曲线。可知，κ-卡拉胶的引入显著提高了GelMA生物墨水的力学性能。在κ-卡拉胶溶解之前，0.1％w/v浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水在50％的应变下显示出优秀的压应力，高达59MPa。
[0061]图2中的(D)为含0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水在37℃磷酸盐缓冲液中浸泡后的压应力-应变曲线。
[0062]图2中的(E)为含0.1％w/v、0.3％w/v和0.5％w/v浓度下κ-卡拉胶/GelMA生物墨水在37℃磷酸盐缓冲液浸泡前后的弹性模量。数据以均数±标准差报告，n＝3。可知，溶解前κ-卡拉胶浓度分别为0.3％w/v和0.5％w/v时，弹性模量最大，接近0.8kPa。
[0063]由图2中的(C)和图2中的(E)可知，随着κ-卡拉胶浓度的增加，κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的压缩模量和韧性均增加，弹性模量和断裂时的应力应变先增大。
[0064]由图2中的(D)和图2中的(E)可知，随着κ-卡拉胶的溶解，断裂时的应力应变和弹性模量下降到与GelMA相似的状态，而κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的应力应变和弹性模量仍略高。
[0065]实施例3
[0066]S1、由图3可知，图3是本发明打印参数优化图。
[0067]图3中的(A)为宏观观察5％ GelMA和0.5％w/v浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的热敏度变化。可知，4℃冷却10min后，从针内挤出的0.5％w/v浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水更加均匀光滑，即使在28℃复温10-60min，固体胶体仍然稳定。但在印刷和挤出过程中，GelMA冷却诱导的胶凝表现出明显的粒度。同时，在28℃复温0.5h后，0.5％w/v浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水开始融化，无法用于打印。
[0068]图3中的(B)为5％ GelMA和0.5％w/v浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水流量和不同同轴喷嘴(外/内:17G/25G，17G/26G，17G/27G)对纤维直径的影响。可知，打印得到的纤维直径可以通过调节材料的流量或外部/内部针头的大小和高度调节。
[0069]图3中的(C)为纤维直径的定量分析(显示平均值，误差条表示独立重复的标准差(SD))。37℃。数据以均数±标准差报告，n＝3。可知，用固定的外针(17G)改变内针(25G-27G)，改变0.5％w/v浓度κ-卡拉胶/GelMA生物墨水的流量(0.01-0.07mL/min)或针的移动速度，可以打印出一系列的纤维。当同轴针的尺寸和材料的流速确定后，随着针的运动速度的增加，纤维直径增大，并对通道直径进行定量分析。
[0070]S2、通过3D生物打印机软件自动切片编程，可以连续挤压并顺利沉积κ-卡拉胶/GelMA生物墨水，从而创建出具有所需形状和结构的大规模复杂结构。
[0071]如图4所示，图4是本发明复杂结构的生物打印图。
[0072]图4中的(A)为生物打印支架，图4中的(B)为分叉血管，图4中的(C)为实体鼻，图4中的(D)为实体耳，可知，κ-卡拉胶/GelMA生物墨水能够在28℃下稳定构建复杂的大型器官结构。
[0073]图4中的(E)为0.3％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水打印基于三周期最小曲面的拓扑立方体。
[0074]图4中的(F)为异质0.3％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水不同比例和空间分布模式的异质生物打印结构。可知，凝胶状的κ-卡拉胶/GelMA生物墨水可以在注射器中进行空间重组。
[0075]图4中的(G)为两种不同的0.3％w/vκ-卡拉胶/GelMA生物墨水打印的分层支架。可知，该结构体具有自发界面截面和梯度孔隙结构，如图垂直截面视图所示。
[0076]实施例4
[0077]κ-卡拉胶/GelMA生物墨水溶解后的生物相容性
[0078]S1、将成骨细胞(MC-3T3，1.0×106个/mL)、人脐带静脉内皮细胞(HUVECs，1.0×106个/mL)和小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs，1.0×106个/mL)引入κ-卡拉胶/GelMA生物墨水和生物打印细胞负载构建体中进行体外培养。
[0079]S2、第1天进行活/死细胞染色，显示细胞均匀分布在生物打印块中，钙黄绿素阳性活细胞占85％以上。
[0080]S3、TRITC鬼笔环肽和DAPI分别对F-肌动蛋白和细胞核进行染色，监测包裹细胞在构建体中的扩散，培养5天后，包裹在构建体中的细胞逐渐扩展为长条状。
[0081]如图5所示，图5是本发明三种细胞的细胞活力和细胞伸展图。
[0082]BMSCs、HUVECs和MC-3T3在支架内包封1天的活/死染色荧光图像。培养3天和5天后，生物打印支架内包封的BMSCs、HUVECs和MC-3T3形态的免疫荧光图像。可知，κ-卡拉胶的使用不会影响GelMA的生物相容性。
[0083]实施例5
[0084]S1、κ-卡拉胶支撑浴的制备：κ-卡拉胶加入100mL磷酸盐缓冲液中，70℃下搅拌30min，得到κ-卡拉胶溶液。放入冰箱内至少2h，使其完全凝胶化。使用电动搅拌器以1000rpm/min将κ-卡拉胶凝胶搅碎成颗粒。由κ-卡拉胶微凝胶颗粒组成的支撑浴再被分装至50mL离心管中，1000rpm/min下离心除去气泡，得到κ-卡拉胶支撑浴。
[0085]S2、ι-卡拉胶支撑浴的制备：ι-卡拉胶加入100mL磷酸盐缓冲液中，70℃下搅拌30min，得到ι-卡拉胶溶液。放入冰箱内至少2h，使其完全凝胶化。使用电动搅拌器以1000rpm/min将ι-卡拉胶凝胶搅碎成颗粒。由ι-卡拉胶微凝胶颗粒组成的支撑浴再被分装至50mL离心管中，1000rpm/min下离心除去气泡，得到ι-卡拉胶支撑浴。
[0086]S3、λ-卡拉胶支撑浴的制备：λ-卡拉胶加入100mL磷酸盐缓冲液中，70℃下搅拌30min，得到λ-卡拉胶溶液。放入冰箱内至少2h，使其完全凝胶化。使用电动搅拌器以1000rpm/min将λ-卡拉胶凝胶搅碎成颗粒。由λ-卡拉胶微凝胶颗粒组成的支撑浴再被分装至50mL离心管中，1000rpm/min下离心除去气泡，得到λ-卡拉胶支撑浴。
[0087]实施例6
[0088]S1、不同浓度κ-卡拉胶支撑浴的制备：分别向0.3％w/v、0.4％w/v和0.5％w/vκ-卡拉胶中加入100mL磷酸盐缓冲液中，70℃下搅拌30min，得到不同浓度的κ-卡拉胶溶液。
[0089]放入冰箱内至少2h，使其完全凝胶化。使用电动搅拌器以1000rpm/min将不同浓度的κ-卡拉胶凝胶搅碎成颗粒。由不同浓度的κ-卡拉胶微凝胶颗粒组成的支撑浴再被分装至50mL离心管中，1000rpm/min下离心除去气泡，得到不同浓度的κ-卡拉胶支撑浴。
[0090]不立即使用的κ-卡拉胶支撑浴可以放置在冰箱(4℃)保存1个月及以上(室温长时间放置会受到的微生物污染)，使用时无需恢复至室温即可使用。
[0091]S11、如图6所示，图6是本发明三种浓度的κ-卡拉胶支撑浴图。
[0092]由图6(下)可知，制备的0.3％w/v和0.4％w/v的κ-卡拉胶支撑浴具有较好的液态样流动性，而0.5％w/vκ-卡拉胶支撑浴流动性较差。所以低浓度的卡拉胶流动性更好，理论上具有较高地自愈合速度，并且浊度也更低，对GelMA的光聚合造成的影响更低。
[0093]S2、无菌κ-卡拉胶支撑浴的制备：先将κ-卡拉胶粉末先在紫外灯辐照30min，再用75％酒精浸泡30min后再进行制备。剩余步骤与κ-卡拉胶支撑浴的制备过程相同，制备好的κ-卡拉胶支撑浴应该避免紫外灯的辐照。无菌κ-卡拉胶支撑浴中加入0.1％w/v双抗溶液进一步地抑制微生物的污染。
[0094]S3、生物墨水的准备：0.05g的GelMA、0.025％光引发剂LAP和5mL的磷酸盐缓冲液溶液装入15mL离心管当中，40℃加热30min制得5％w/vGelMA。5％w/v GelMA在50℃下加热5min，使用无菌的0.2μm除菌器过滤灭菌。除菌后的5％w/v GelMA混合提前收集好的细胞，混匀后装入无菌注射器，载细胞的墨水载细胞数目为1×107/mL。为了打印过程更容易被观察，墨水中打印时极少量的添加了中性笔的油墨。
[0095]S4、不同浓度κ-卡拉胶支撑浴理化性质
[0096]S41、按照S1中的步骤制备得到浓度分别为0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v的κ-卡拉胶支撑浴。
[0097]S42、流变学测量：使用流变仪(HAAKE)进行测量，利用20mm的平行夹具，1mm的gap，所有实验的检测频率都为10Hz。除Flow temparature外，其他实验测量温度均为25℃。Flowtemperature的实验温度从10℃到40℃，温度匀速增加(Ramp模式)。
[0098]S43、电子显微镜：对0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v的κ-卡拉胶支撑浴进行电镜扫描。如图6(上)所示，可知，三个浓度的κ-卡拉胶支撑浴中颗粒均不足1μm。
[0099]S5、对图7进行分析：如图7所示，图7是本发明三个浓度的κ-卡拉胶支撑浴的性能图。
[0100]图7中的A为旋转实验，剪切速率0.001-100mm/s，观测κ-卡拉胶支撑浴在不同剪切速率下的粘度的变化。各个浓度的屈服应力：0.3％w/v，τ0＝0.46Pa；0.4％w/v，τ0＝0.47Pa；0.5％w/v，τ0＝0.92Pa。
[0101]图7中的B为对κ-卡拉胶支撑浴应变振荡扫描，应变范围0.025％-10％，观测κ-卡拉胶支撑浴随着应力变化后，高弹性向高流动性(粘性)转化的过程。
[0102]由图7中的A和图7中的B可知，κ-卡拉胶支撑浴极小的低屈服应力保证了在针头移开后，在周围静水压的作用下可以快速屈服并愈合。
[0103]图7中的C为连续使用低应变(1％)和高应变(100％)交替振荡扫描，模拟κ-卡拉胶支撑浴从液态到固态反复转换的能力。可知，使用低应变和高应变交替振荡的方法，测试κ-卡拉胶支撑浴持续的恢复能力与稳定性时，经过两个循环测试后，κ-卡拉胶支撑浴的弹性模量没有变化，说明它可以在打印过程中保持稳定的支撑作用。
[0104]图7中的D为先用0.01％作用1s，再用一个100％作用0.1s，再恢复到低应变观测粘度恢复的时间。
[0105]图7中的E为先用0.01％作用1s，再用一个100％作用0.1s，再恢复到低应变观测粘度恢复时间的详细图。
[0106]由图7中的D和图7中的E可知，κ-卡拉胶支撑浴展现出极小的低屈服应力(0.46pa左右)，保证了在针头移开后，在周围静水压的作用下可以快速屈服并愈合，及时填补被针头划开的空间，将针头移动时挤出的材料包埋，避免打印墨水上升。针头离开打印区域后，流动的液态κ-卡拉胶支撑浴快速地恢复到弹性为主的固体状态，该特性使得κ-卡拉胶支撑浴可以快速包裹打印丝径并且通过高模量的支撑能力避免打印丝坍塌变形。
[0107]κ-卡拉胶支撑浴的自愈合速度快，三个浓度的κ-卡拉胶支撑浴从液态样转换成固态样仅需大约0.03s。
[0108]图7中的F为测试κ-卡拉胶支撑浴从10-40℃的粘度的变化，温度匀速地从10℃增加到40℃，变化速度5℃/min。15-25℃下，三种浓度的κ-卡拉胶支撑浴均表现出稳定的状态，利于在室温下打印的稳定性。
[0109]在37℃左右时，0.3％w/vκ-卡拉胶支撑浴和0.4％w/vκ-卡拉胶支撑浴的粘度明显下降了四个数量级，说明κ-卡拉胶支撑浴是高度热敏感的，便于去除陷入打印封闭空腔内或者精细的狭小缝隙内的卡拉胶颗粒。
[0110]图7中的G为应力-剪切速率关系图，展现了三个浓度的κ-卡拉胶支撑浴和5％w/vGelMA拟合Herschel-Bukley流体模型的情况，拟合度分别为：0.3％w/v，0.91；0.4％w/v，0.89；0.5％w/v，0.91。当打印的墨水和支撑浴都是Herschel-Bukley流体时，打印的丝径更容易具有圆柱状的丝径。
[0111]图7中的H为打印并光交联的镂空球悬浮在κ-卡拉胶支撑浴当中。镂空球体为GelMA在0.4％w/vκ-卡拉胶支撑浴中打印的，用于观察0.4％w/vκ-卡拉胶支撑浴的37℃下的热溶解情况。405nm光照固化打印的镂空球后，打印的整个容器被放置在37℃水浴锅当中。
[0112]图7中的I为κ-卡拉胶支撑浴在37℃水浴中时间增长，镂空球逐渐下落并且塌陷。可知，随着加热时间的增加，κ-卡拉胶支撑浴边缘出现快速热运动并逐渐溶解，8min后镂空球的一部分开始下坠，10min后镂空球完全地失去了κ-卡拉胶支撑浴的支撑，整个坍塌在容器的底部。
[0113]综上所述，0.3％w/vκ-卡拉胶支撑浴和0.4％w/vκ-卡拉胶支撑浴在37℃的温度下可短时间内溶解。综合比较各浓度的κ-卡拉胶支撑浴，37℃时0.5％w/vκ-卡拉胶支撑浴热溶效果差。0.3％w/vκ-卡拉胶支撑浴的温度稳定范围较窄，在27℃左右即可热溶，再加之其粘度较低，流动性较好，会导致在打印过程中晃动。因此，0.4％w/vκ-卡拉胶支撑浴被选择用于验证5％ GelMA打印的可能性。
[0114]实施例7
[0115]S1、简单模型的打印：使用接枝了罗丹明B的5％ GelMA墨水在κ-卡拉胶支撑浴中分别打印直线条、螺旋线条和简单的栅格结构。
[0116]S2、复杂模型的打印：
[0117]S21、从NIH网站(https://3d.nih.gov/)上下载具有复杂沟回结构的左脑模型，然后缩小至0.4倍用Repetier Host切片，用内径0.06nm，外径0.25nm的针头打印。
[0118]S22、在3D body数据库(http://lifesciencedb.jp/bp3d/)上寻找到了一个完整的心脏模型，用Rhino软件(https://www.rhino3d.com/)加粗了心脏的壁厚，删除了大部分的血管结构以便可以切片打印。左侧和右侧两根血管被保留并且加粗用于观测打印的精度。修改后的心脏模型具备显著的腔室结构和血管，缩小至0.5倍后用于切片打印。
[0119]S23、除了实体结构和含少量空腔的实体结构，选取了一个薄壁的多分枝的冠状动脉血管结构进行打印。
[0120]S24、绘制一个不足1cm3尺寸的含螺旋流道的血管芯片结构并打印，设计含两分枝和四分枝的芯片并打印，设计三分枝的空间流道芯片并打印。
[0121]上述芯片模型均使用Blender(https://www.blender.org/)绘制，流道部分先绘制好路径后进行实体化，多分枝使用Booler运算对单独绘制好的零件进行合并。再使用矩形的结构减去提前绘制好的流道即可获得含流道的芯片结构。所有的模型切片前都用netfabb(https://www.autodesk.com/products/netfabb/)进行流体结构的检测和修复。
[0122]S3、对S2中的打印模型进行分析
[0123]S31、如图8所示，图8是本发明直接在κ-卡拉胶支撑浴中打印结构图。
[0124]打印针规格：内径0.06mm外径0.25mm。体式显微镜拍摄，10x。
[0125]图8中的A、浸泡在κ-卡拉胶支撑浴当中的200mm/min、400mm/min、600mm/min和800mm/min打印的直线条，共聚焦显微镜层扫观察打印丝径的粗细、形貌和截面观察丝径的圆度。可知，κ-卡拉胶支撑浴支持5％ GelMA打印近似圆柱状的丝径。通过改变打印速度和挤出流量可调控丝径，同时，由于GelMA粘度较低，可采用极细针头(内径：0.18μm；外径：0.22μm)打印出高精度的丝(≈200μm)，对超高精度结构的构建极为有利。
[0126]图8中的B、打印速度和打印丝径粗细的关系图。打印速度和打印丝径的粗细的关系呈负相关，相关性为97％。图为浸泡在κ-卡拉胶支撑浴的GelMA打印丝共聚焦层扫图像的投影图，n＝3。
[0127]图8中的C、支持浴内螺旋路径打印的展示。可知，螺旋上升的打印的路径光滑，丝径没有显著的不规则和变形，说明κ-卡拉胶支撑浴支持打印针头的三维空间的自由移动。
[0128]图8中的D、延时拍摄了一根GelMA打印丝，每10min捕获一张，追踪1h。6h后再拍摄一张图像。分别计算不同时间打印丝的宽度。n＝3，每根丝径至少测量三次。可知，0min与打印后浸没在κ-卡拉胶支撑浴内70min后的打印丝的宽度无统计学差异(P＝0.27＞0.5)，6h后打印丝平均增加了60μm(约原始宽度的1/5)。
[0129]图8中的E、打印的栅格结构浸泡罗丹明B后用于共聚焦层扫。10X；NA＝0.95。精细栅格结构的打印丝和打印丝间距为200μm。
[0130]图8中的F、用5％ GelMA打印出的栅格结构固化后取出在磷酸盐缓冲液当中，打印好的栅格浸泡稀释的中性油墨后用于展示打印的栅格结构的截面(5mm)。
[0131]图8中的G、用5％ GelMA打印出的栅格结构固化后取出在磷酸盐缓冲液当中，打印好的栅格浸泡在稀释的中性油墨中用于展示打印的栅格结构的截面(1mm)。
[0132]由图8中的E、图8中的F和图8中的G可知，打印的栅格结构的俯视图和选取部分的光镜的微观图像表明打印的丝径没有扭曲堆积的形态，打印丝稳定地展现成圆柱状。κ-卡拉胶支撑浴可以支持在直径25mm的硬币尺度内打印一个单层超过100个孔径的栅格结构，并通过405nm光照固化后取出，证明了0.4％w/vκ-卡拉胶支撑浴对GelMA的光交联影响甚微。
[0133]综上所述，0.4％w/vκ-卡拉胶支撑浴支持5％ GelMA的自由和稳定地构建高精度的结构。
[0134]S32、如图9所示，图9是本发明在κ-卡拉胶支撑浴中用GelMA墨水打印脑、心脏和分枝冠状动脉模型图。
[0135]打印针头规格：内径0.06nm、外径0.25nm。
[0136]图9中的A、左脑模型的内侧(左)和右侧(右)面。
[0137]图9中的B、5％ GelMA打印的左脑浸泡在磷酸盐缓冲液当中的内侧(左)和右侧(右)面。
[0138]图9中的C、打印的左脑放在空气当中，用稀释的中性笔油墨染色后展示左脑的沟回结构。可知，打印出的左脑依旧可以展示出微观沟回结构。
[0139]图9中的D、打印心脏的示意图(左)，心脏模型的右侧(中间)和左侧(右)。
[0140]图9中的E、κ-卡拉胶支撑浴当中的5％ GelMA打印的心脏结构。
[0141]图9中的F、打印的心脏结构取出浸泡在磷酸盐缓冲液当中，用稀释的中性笔油墨分别灌注右侧腔室和左侧腔室。可知，上腔静脉处(位置1)注入的染料可以依次通达到右心房和右心室，并从肺动脉处(位置2)流出，红色染料从主动脉(位置4)注入，从左心室，经左心房从肺静脉(位置3)流出。
[0142]图9中的G、混合少量中性笔油墨的5％ GelMA打印的心脏的矢状面剖面图，实心三角处为肺静脉。
[0143]图9中的H、含油墨的墨水的墨水打印的心脏的内侧(左)和右侧(右)面，分别展示模型中设计的血管样结构。
[0144]图9中的I、心脏的冠状动脉的模型(上)，在κ-卡拉胶支撑浴(中)和取出在磷酸盐缓冲液(下)中的打印的结构。
[0145]打印的保真度通过比较打印模型和实物各分枝的夹角差异来衡量，所选的模型和打印实物之间的血管分枝的夹角差别均不超过6°。尽管每个夹角都测量了三次以减少测量时手动勾选造成误差，但是拍摄时镜头的角度造成的误差依然存在。综上所述，κ-卡拉胶支撑浴支持含毫米级结构、内部腔室和多分枝等特点的复杂结构的打印。
[0146]S33、如图10所示，图10是本发明在κ-卡拉胶支撑浴中打印含流道的芯片图。
[0147]打印针头规格：内径0.06nm、外径0.25nm。
[0148]图10中的A、含单螺旋芯片的示意图(左一)，磷酸盐缓冲液中5％ GelMA打印的含单螺旋通道的芯片结构(左二)和稀释中性油墨灌注的芯片浸泡在磷酸盐缓冲液中(右二)和直立在空气(右一)的两种状态。可知，单螺旋流道的芯片竖立在空气中，顶部滴加的染料顺着流道螺旋地下降，灌注过程十分流畅。
[0149]图10中的B、含双螺旋芯片的示意图(左)，磷酸盐缓冲液中5％ GelMA打印的含双螺旋通道的芯片结构(中)，直立在空气被稀释中性油墨灌注的芯片(右)。分别使用油墨灌注，独立的油墨说明毫米级的矩形凝胶结构内的两条空间螺旋的流道互不干扰。
[0150]图10中的C、含立体三流道的芯片的示意图(上)，染料灌注后的截面(中)和俯视图(下)。截面展示了芯片的空间流道，且流道直径在600μm左右，证明了κ-卡拉胶支撑浴在分枝流道芯片打印时具有应用前景。
[0151]图10中的D、含二分枝流道的芯片(左)，磷酸盐缓冲液中的打印的结构(中)，染料灌注的芯片(右)。
[0152]图10中的E、含四分枝流道的芯片的示意图(左)，磷酸盐缓冲液中的打印结构(中)和染料灌注的状态(右)。
[0153]由图10中的D和图10中的E可知，结果表明在1cm3左右的体积内可以成功打印直径约600μm的流道结构，且κ-卡拉胶支撑浴打印的管道结构的精度接近一些牺牲打印策略的精度。
[0154]综上所述，κ-卡拉胶支撑浴对于含仿真脉管凝胶结构的制造具有广阔地应用前景。
[0155]实施例8
[0156]验证κ-卡拉胶支撑浴打印后的细胞活性
[0157]S1、κ-卡拉胶支撑浴打印
[0158]S11、对κ-卡拉胶的粉末进行紫外辐照30min以上，再用75％的消毒酒精浸泡30min以上，κ-卡拉胶粉末加入100mL磷酸盐缓冲液中，70℃下搅拌30min，得到κ-卡拉胶溶液。放入冰箱内至少2h，使其完全凝胶化。使用电动搅拌器以1000rpm/min将κ-卡拉胶凝胶搅碎成颗粒。由κ-卡拉胶微凝胶颗粒组成的支撑浴再被分装至50mL离心管中，1000rpm/min下离心除去气泡，得到κ-卡拉胶支撑浴。
[0159]S12、选取HUVECs、BMSC和MC-3T3三种细胞，用5％ GelMA载细胞在κ-卡拉胶支撑浴内打印栅格结构(避免营养渗透不足的干扰)，打印的栅格结构直接取出后浸泡在培养基中，37℃恒温箱内培养30min后更换培养基和培养皿。继续培养2h后再次更换培养基和培养皿，保证κ-卡拉胶充分地溶解和去除。
[0160]S13、24h内取出清洗后用活/死染色实验观察活细胞和死细胞的情况，培养一周后进行细胞培养和细胞骨架、活/死染色实验，通过观察细胞的形态和细胞的伸展情况来判断细胞的活性。
[0161]S2、如图11所示，图11是本发明κ-卡拉胶支撑浴内用载细胞的GelMA打印栅格和骨样的结构图。
[0162]打印针头规格：内径0.06nm、外径0.25nm。
[0163]图11中的A、κ-卡拉胶支撑浴当中打印栅格结构的示意图，随着37℃的培养，支撑浴溶解。
[0164]图11中的B、5％ GelMA打印的栅格结构宏观图俯视图(左)和侧面图(右)，丝间距0.6mm，层高0.4mm。
[0165]图11中的C、载HUVEC打印后，24h内用活/死染色实验检查细胞的活力情况。可知，细胞的存活率在90％以上，这说明该打印过程和κ-卡拉胶支撑浴不会影响细胞活性。
[0166]图11中的D、载HUVEC的栅格结构培养一周，选取的第一天，第四天和第六天的HUVECs的光镜下的形态。第1天，可见HUVECs形成明显的的液泡，白色箭头(左)。第4天和第6天细胞相互伸展连接(黑色箭头，中间和右边)。液泡结构是内皮细胞自发组装毛细血管的基本单元，培养到第4天时，很多HUVECs呈现上皮样，伸出阿米巴样的伪足，细胞与细胞之间相互连接，第6天时可见部分区域出现液泡样的结构。
[0167]图11中的E、培养了6天的载HUVECs和培养了11天载BMSCs栅格结构的projection的免疫荧光图。
[0168]图11中的G.、载MC-3T3细胞骨形态样的结构的全貌(左)和局部(右)的组合的免疫荧光图。
[0169]图11中的H、培养了7天的载MC-3T3栅格结构的组合免疫荧光图。可知，培养11天的BMSCs和7天的MC-3T3细胞，细胞骨架伸展，细胞和细胞相互连接。载MC-3T3尺寸更大的骨样结构在κ-卡拉胶支撑浴中打印后，培养7天后细胞和细胞伸展并且相互连接成网，说明了MC-3T3细胞展现出很好的活性。
[0170]综上所述，κ-卡拉胶支撑浴具有生物相容性。
[0171]最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围